多巴胺是一種重要的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，用來(lái)幫助細(xì)胞傳送脈沖，它與帕金森氏癥、藥物成癮、精神分裂癥、多動(dòng)癥和創(chuàng)傷后壓力綜合征等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。

為更好地研究多巴胺在生理和病理過(guò)程中的作用，研究人員需要擁有一種能夠?qū)崟r(shí)、靈敏、特異地監(jiān)測(cè)多巴胺的趁手“兵器”。此前，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李毓龍實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了一系列監(jiān)測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的熒光探針，其中包括第一代多巴胺探針。

10月22日，李毓龍實(shí)驗(yàn)室與美國(guó)紐約大學(xué)和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院合作，在《自然·方法學(xué)》雜志在線發(fā)表論文，報(bào)告了新型紅色熒光多巴胺探針和第二代綠色熒光多巴胺探針的開(kāi)發(fā)應(yīng)用成果。

綠色熒光探針讓細(xì)胞自己發(fā)光

多巴胺是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，這種腦內(nèi)分泌物與運(yùn)動(dòng)控制、動(dòng)機(jī)、學(xué)習(xí)、記憶、情緒等生理過(guò)程有關(guān)，負(fù)責(zé)傳遞興奮及開(kāi)心的信息，具有調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能。

20世紀(jì)50年代，瑞典科學(xué)家阿爾維德·卡爾森確定了多巴胺是腦內(nèi)信息傳遞者的角色，讓人們認(rèn)識(shí)到一旦人類(lèi)多巴胺調(diào)節(jié)系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，往往會(huì)出現(xiàn)帕金森氏癥、精神分裂癥、抽動(dòng)穢語(yǔ)綜合征、注意力缺陷多動(dòng)綜合征以及垂體腫瘤的發(fā)生等。卡爾森據(jù)此研制出治療這類(lèi)疾病的藥物，并獲得了2000年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

“科學(xué)家如果擁有一種能以高時(shí)空分辨率、高特異性和高靈敏度感知多巴胺濃度變化的工具，將有助于研究多巴胺在生理和病理?xiàng)l件下的多種功能，去追蹤在活體模式生物中、復(fù)雜行為模式下多巴胺信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化情況。”李毓龍說(shuō)。

傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法，主要是通過(guò)微透析對(duì)腦脊液進(jìn)行采樣并生化監(jiān)測(cè)、通過(guò)碳纖電極進(jìn)行記錄等。這些監(jiān)測(cè)手段各自存在一些局限性，如缺乏足夠的時(shí)間和空間分辨率，難以精確反映神經(jīng)遞質(zhì)的真實(shí)動(dòng)態(tài)信息;監(jiān)測(cè)特定神經(jīng)遞質(zhì)的特異性不夠高;監(jiān)測(cè)方法對(duì)生物的損傷性大等。因此，科學(xué)家一直致力于優(yōu)化已有方法，或者開(kāi)發(fā)新方法，力圖彌補(bǔ)短板，取得突破。

自2018年起，李毓龍實(shí)驗(yàn)室就開(kāi)發(fā)出可基因編碼的熒光探針系列，即GRAB探針系列，其中包括多巴胺探針。李毓龍表示，最重要的一點(diǎn)是，他們的新方法“能讓細(xì)胞自己發(fā)光”。

此前，許多生物學(xué)家已經(jīng)解決了如何把熒光蛋白“放”到細(xì)胞里的難題。只要在細(xì)胞中轉(zhuǎn)入編碼基因的特定信息序列，細(xì)胞自己就會(huì)通過(guò)“中心法則”，把這個(gè)信息序列“翻譯”成特定的蛋白質(zhì)。這個(gè)能被可見(jiàn)光激發(fā)產(chǎn)生紅色或綠色熒光的蛋白質(zhì)會(huì)自動(dòng)“走”到細(xì)胞膜上，還會(huì)對(duì)多巴胺敏感，也就是結(jié)合神經(jīng)遞質(zhì)后發(fā)出熒光信號(hào)，從而報(bào)告信號(hào)位置。

“然后你就可以拍照，或拍個(gè)視頻，哪個(gè)地方亮，哪個(gè)地方就有多巴胺釋放。”李毓龍向科技日?qǐng)?bào)記者介紹，這樣就可以通過(guò)熒光成像的方法，將原本不可見(jiàn)的神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，轉(zhuǎn)變成直觀、易測(cè)的熒光信號(hào)，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，創(chuàng)造性地克服了已有多巴胺監(jiān)測(cè)手段中時(shí)空分辨率低、分子特異性差等諸多問(wèn)題，而且對(duì)細(xì)胞幾乎不會(huì)造成損傷。

他們通過(guò)轉(zhuǎn)染、病毒注射等手段，將探針表達(dá)在細(xì)胞、小鼠腦片或活體的果蠅、斑馬魚(yú)、小鼠上，監(jiān)測(cè)到了電刺激小鼠腦片引發(fā)的多巴胺釋放，并在活體果蠅、斑馬魚(yú)和小鼠的大腦中監(jiān)測(cè)到了與嗅覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、學(xué)習(xí)記憶、交配行為相關(guān)的多巴胺信號(hào)變化。

升級(jí)版探針可以多色“合作”

近兩年來(lái)，李毓龍團(tuán)隊(duì)對(duì)研發(fā)的第一代探針進(jìn)行了改造和優(yōu)化。“就像電腦的芯片，從第一代到第二代，它的運(yùn)算速度越來(lái)越快，多巴胺探針，更新?lián)Q代后變得更靈敏，而且所帶來(lái)的非損傷性或者說(shuō)副作用要更少。”李毓龍說(shuō)。

第一代多巴胺探針的局限在于，只有在多巴胺釋放較多的時(shí)候才能夠監(jiān)測(cè)到，監(jiān)測(cè)也需要較長(zhǎng)的時(shí)間。但如果有了更靈敏的探針，就可以實(shí)時(shí)地在一些精細(xì)的動(dòng)物行為學(xué)上——比如說(shuō)受獎(jiǎng)賞或受懲罰時(shí)，抑或是在成癮或疾病發(fā)作時(shí)，更精準(zhǔn)地監(jiān)測(cè)多巴胺的動(dòng)態(tài)變化。針對(duì)新一代多巴胺探針，李毓龍等人在細(xì)胞、腦片、果蠅、小鼠中對(duì)其表現(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，并通過(guò)一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)探針信號(hào)的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。

新一代探針還提供了多樣化監(jiān)測(cè)的可能。“探針是由熒光蛋白和神經(jīng)遞質(zhì)受體二者組合而成的。我們?cè)诘谝淮结樀幕A(chǔ)上，對(duì)這兩部分蛋白交互界面的重要氨基酸依次嘗試了不同的種類(lèi)變化，并逐個(gè)監(jiān)測(cè)探針的特性;隨后對(duì)表現(xiàn)優(yōu)秀的氨基酸變化形式進(jìn)行排列組合，以實(shí)現(xiàn)‘強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合’，達(dá)到最優(yōu)化的探針監(jiān)測(cè)效果。”李毓龍說(shuō)。此外，他們嘗試更換不同種類(lèi)的熒光蛋白，開(kāi)發(fā)出不同熒光顏色的探針。

“在我們的大腦中，有很多很復(fù)雜的化學(xué)信號(hào)，多巴胺只是其中一種。”李毓龍解釋說(shuō)，除了令人愉悅的多巴胺，還有被認(rèn)為管理著壓力感的腎上腺素，或者是調(diào)節(jié)抑郁情緒的5-羥色胺。

因此，當(dāng)有一個(gè)對(duì)“幸福感”敏感的多巴胺紅色探針，以及對(duì)抑郁情緒或壓力感敏感的綠色神經(jīng)遞質(zhì)探針在一起工作時(shí)，人們就可以同時(shí)看到不同神經(jīng)遞質(zhì)之間的關(guān)系，從而更好地理解大腦的化學(xué)物質(zhì)如何進(jìn)行協(xié)同變化。

他們開(kāi)發(fā)的新型紅色熒光多巴胺探針，可與其他鈣離子探針、神經(jīng)遞質(zhì)探針等綠色熒光探針共同使用，實(shí)現(xiàn)多種信號(hào)的同時(shí)記錄。另外他們還優(yōu)化出具有更高靈敏度及成像信噪比的第二代綠色熒光多巴胺探針。

體外實(shí)時(shí)探測(cè)多巴胺不是夢(mèng)

人們監(jiān)測(cè)大腦內(nèi)化學(xué)物質(zhì)之前多使用的是化學(xué)方法，比如通過(guò)試劑監(jiān)測(cè)受體的化學(xué)反應(yīng);或者通過(guò)質(zhì)譜法，來(lái)監(jiān)測(cè)特定大小的分子。“化學(xué)試劑本身是有毒的;質(zhì)譜法要首先讓這些分子離子化，活細(xì)胞根本無(wú)法承受。”李毓龍表示，所以這些監(jiān)測(cè)方法不適合在活體動(dòng)物中使用。

李毓龍團(tuán)隊(duì)運(yùn)用新一代多巴胺探針，在活體動(dòng)物自由活動(dòng)時(shí)也能記錄其深部腦區(qū)中多巴胺的動(dòng)態(tài)變化。相比于第一代探針，經(jīng)過(guò)優(yōu)化得到的第二代綠色熒光探針，熒光更亮，結(jié)合神經(jīng)遞質(zhì)后信號(hào)變化更顯著。此外，新型紅色熒光探針在對(duì)多巴胺監(jiān)測(cè)時(shí)，從先前的單一綠色熒光拓展到多色熒光。因此，兩款新型探針可以更容易與神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域其他重要技術(shù)，如鈣成像、光遺傳學(xué)等結(jié)合使用。新型探針也為多巴胺受體的相關(guān)藥物篩選優(yōu)化提供了新的可能。

李毓龍向記者介紹，目前他們已著手研發(fā)更新一代的熒光探針，讓紅光更紅。“因?yàn)樵诨铙w中，探針就像信號(hào)燈或者是導(dǎo)航燈，更紅的光穿透力更強(qiáng)，信噪比更高，也更容易監(jiān)測(cè)到。”現(xiàn)在監(jiān)測(cè)這些熒光信號(hào)，人們還得給動(dòng)物體內(nèi)加一根光纖，才能夠監(jiān)測(cè)到多巴胺信息。

想要觀測(cè)動(dòng)物大腦里是“怎么想”的，更真實(shí)、準(zhǔn)確地理解其神經(jīng)系統(tǒng)怎么工作，需要熒光探針有足夠的亮度，甚至在自由活動(dòng)的動(dòng)物體外也可直接看到紅色的、穿透力足夠強(qiáng)的光。“這些理論上是可以實(shí)現(xiàn)的。”李毓龍說(shuō)，而這正是他們努力的方向。(趙漢斌)